万历十六年（1588年），赵用贤上疏《南雍七事》，并推荐举人王之士、邓元锡、刘元卿。四月十二日，赵用贤请加强圣学，明神宗同意了他的请求。八月二日，赵用贤发寒疾，沉绵月余。九月二十六日，赵用贤上疏请告，明神宗不允。十二月八日（1589年），赵用贤旧疾复发。
万历十七年（1589年）正月，赵用贤再疏请归。不久，赵用贤又请求设立储君，饶恕言官李沂罪过。八月七日，赵用贤被提升为南京礼部右侍郎。
万历十九年（1591年），离南京任，启程返家。行至京口，遇风雨，船几覆，导致旧疾复发。抵家后，病势加剧，遂于三月间上疏请告。夏，赵用贤又患寒热，再次上疏乞休，并致书陆光祖，请准其归。
万历二十年（1592年）春，赵用贤到北京就任。六月二十五日，明神宗擢升赵用贤为礼部左侍郎兼翰林院侍读学士，命他教习庶吉士。
万历二十一年（1593年）正月，王锡爵入都，赵用贤致书劝其力诤建储大事。正月二十六日，赵用贤又以争三王同时分封的话中牵涉到王锡爵，被王锡爵所怀恨。七月十日，赵用贤改任吏部左侍郎。七月十五日，赵用贤到任管事，当时吏部尚书暂缺，由赵用贤署印。又与文选郎顾宪成辩论人才，群情激愤，王锡爵颇感不安。七月二十八日，赵用贤过去所回绝婚约的吴之彦唆使他的儿子吴镇攻击赵用贤论财赶走女婿，蔑视法律废弃伦理。赵用贤上疏辩解，乞求退休。明神宗下诏让礼官评议。尚书罗万化以吴之彦是他的门生，怕引起嫌疑极力推辞。王锡爵于是上疏说：“赵用贤轻易地回绝，吴之彦后来才揭发，都有过失。现在的赵用贤女儿已出嫁了，难以询问当时的盟约，吴之彦的儿子还没结婚，不能再反坐定罪。想采取折衷的办法，应让赵用贤称病归家，而宽恕吴之彦。”明神宗于是在八月二日下诏同意了赵用贤的请辞。不久，户部郎中杨应宿、郑材又极力诋毁赵用贤，请依据法律从事。都御史李世达、侍郎李祯上疏替赵用贤抱不平，责备两人谄媚，于是遭攻击。高攀龙、吴弘济、谭一召、孙继有、安希范等都因申救被降职。从此朋党之争更加激烈。吴中行、赵用贤、李植、江东之首创于前，邹元标、李南星、顾宪成、高攀龙继续。言官更加注意品评执政之人，执政也日与其争持。水火不相容，到明代灭亡才停止。九月十一日，赵用贤上疏为自己辩护，明神宗同意其病痊后叙用。
万历二十四年（1596年）三月间，赵用贤遭家奴背叛，一病不起。三月十五日，赵用贤去世，享年六十二岁。
万历二十五年三月十一日（1597年），明神宗赐予赵用贤祭一坛。
万历三十八年（1610年）正月，礼部奏请谥典，认为应该对故去的赵用贤给予谥号。二月十九日，南京户部郎中郑材携私阻挠对赵用贤赐谥。
天启初年，明熹宗赠赵用贤为太子少保、礼部尚书，谥号文毅。
赵用贤便编著有《赵定宇书目》、《松石斋集》、《三吴文献志》、《国朝典章》、《因革录》等。
赵用贤还是著名的藏书家，宅有书斋曰“脉望馆”。平生藏书丰富，且多秘本、善本。因为他能够阅览皇家秘阁藏书，凡秘本、善本，就借来抄写，废寝忘食。据《赵定宇书目》所载，赵用贤收藏的秘本、善本达3300余种、4900余册，其中《稗统》正编、续编约有500种稀世孤本。其子赵琦美也酷爱藏书。他们父子的藏书在后世辗转流传，几易其手，流散不少。部分保留下来的藏书，目前珍藏在国家图书馆，殊为珍贵。其“脉望馆”与钱谦益的“绛云楼”、毛晋的“汲古阁”等著名藏书楼齐名，在中国古代藏书史上有很高地位。
赵用贤生前藏书室——脉望馆目前还存主轴，占地面积约1400平方米，宅内大木构架、梁枋彩画、雕花柱础、雕花踢脚砖和丁字斗拱等均为明代原物，现为全国重点文物保护单位。